학습목표• 단백질 수준의 분자생물학 실험의 중요성을 설명할 수 있다.• SDS-PAGE의 원리를 이해하고 설명할 수 있다. 복습• Cell line vs Primary cell / Adherent cell vs Suspension cell• Protocol1. 吸引(세포가 다르면 팁 바꾸는 것 잊지않기) 2로 셀 미디어를 분리합니다. 각 플레이트를 PBS3로 세척합니다. 흡인 4로 PBS를 제거합니다. TE를 3ml 발라 배양합니다. (TE 양, incubation time은 세포에 따라 달라질 수 있음)5. 약 7ml의 배지를 더하고, 15ml의 팔콘 튜브 6에 세포를 채취합니다. 1200 RPM에서 3분간 원심 분리합니다. 흡인 8로 윗맑음을 제거합니다. 1㎖의 medium과 count9의 셀을 일시 정지합니다. Add additional medium to the tube if required and plate• 세포 상태 확인 방법: 배지 색깔/현미경사진/Mycoplasma test/STR 검사단백질 수준 분석의 중요성• 세포 수준의 기능은 결국 단백질로 매개됨[정상 기능/질병] 단백질 수준 분석 방법• 체내 면역 체계인 항원/항체 반응을 단백질 분석 방법에 활용• Antibody Binding/Target Detection- 항체 항원 결합은 단백질 수준 분석의 핵심 원리 분석하고 싶은 단백질 (항원)을 잡는 항체를 활용하여 여러 방법으로 평가 학습목표• 단백질 수준의 분자생물학 실험의 중요성을 설명할 수 있다.• SDS-PAGE의 원리를 이해하고 설명할 수 있다. 복습• Cell line vs Primary cell / Adherent cell vs Suspension cell• Protocol1. 吸引(세포가 다르면 팁 바꾸는 것 잊지않기) 2로 셀 미디어를 분리합니다. 각 플레이트를 PBS3로 세척합니다. 흡인 4로 PBS를 제거합니다. TE를 3ml 발라 배양합니다. (TE 양, incubation time은 세포에 따라 달라질 수 있음)5. 약 7ml의 배지를 더하고, 15ml의 팔콘 튜브 6에 세포를 채취합니다. 1200 RPM에서 3분간 원심 분리합니다. 흡인 8로 윗맑음을 제거합니다. 1㎖의 medium과 count9의 셀을 일시 정지합니다. Add additional medium to the tube if required and plate• 세포 상태 확인 방법: 배지 색깔/현미경사진/Mycoplasma test/STR 검사단백질 수준 분석의 중요성• 세포 수준의 기능은 결국 단백질로 매개됨[정상 기능/질병] 단백질 수준 분석 방법• 체내 면역 체계인 항원/항체 반응을 단백질 분석 방법에 활용• Antibody Binding/Target Detection- 항체 항원 결합은 단백질 수준 분석의 핵심 원리 분석하고 싶은 단백질 (항원)을 잡는 항체를 활용하여 여러 방법으로 평가
Note)-TE:Trypsin-EDTA-DNA<RNA:발현량 분석에 중요-RNA<단백질:기능 분석에 중요-single protein analysis 하면 되잖아요?→ 기술력 부족(protein은 증폭 불가능)-RNA분석상에서 유의하게 나온 인자와 단백질 분석을 통하여 유의하게 나온 인자를 분석하고 2가지 사이의 상관 관계를 분석(1)Western blot개요(Note)-단백질의 양 측정-Cellysis:RIPA buffer등 SDS-PAGE:DNA전기 이동 같은 원리, gel을 바꾸어 씁니다.아미노산 전하는 제각각이어서 하나의 전하에 통일시키는 작업이 필요-electro-transfer:전기를 이용하고 단백질을 gel에서 membrane에 옮기-antibody probing:일차, 이차 항체를 만듭니다
– 1. SDS-PAGE gel에 단백질 샘플을 옮겨 분리한다. – 2. 전기를 통해 분리된 단백질을 PVDF 또는 nitrocellulose 막으로 옮긴다. – 3. blocking : 중성 단백질(BSA 또는 우유)을 이용하여 막을 차단한다. – 항체치료제: FC region(불변부위)에서 독성이 발생하는 경우가 많음 → 면역세포와 binding 할 수 있기 때문에 → 항체의 항원결합부위만 특이적으로 항원에 결합할 수 있도록 blocking 필요-4. 목표 단백질에 특이적인 1차 항체와 함께 막을 배양한다. – 5. 1차 항체에 특이적이며 HRP로 표지된 2차 항체와 함께 막을 배양한다. – 6. blot을 화학발광하는 HRP 기질과 함께 배양하여 film에 노출시킴. – 1. SDS-PAGE gel에 단백질 샘플을 옮겨 분리한다. – 2. 전기를 통해 분리된 단백질을 PVDF 또는 nitrocellulose 막으로 옮긴다. – 3. blocking : 중성 단백질(BSA 또는 우유)을 이용하여 막을 차단한다. – 항체치료제: FC region(불변부위)에서 독성이 발생하는 경우가 많음 → 면역세포와 binding 할 수 있기 때문에 → 항체의 항원결합부위만 특이적으로 항원에 결합할 수 있도록 blocking 필요-4. 목표 단백질에 특이적인 1차 항체와 함께 막을 배양한다. – 5. 1차 항체에 특이적이며 HRP로 표지된 2차 항체와 함께 막을 배양한다. – 6. blot을 화학발광하는 HRP 기질과 함께 배양하여 film에 노출시킴.
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Note) – DNA전기영동에서 agarose gel과 같은 역할 – 아크릴아마이드와 비스아크릴아마이드는 신경독이므로 주의 4-1) 필요한 재료 및 시약 Note) – DNA전기영동에서 agarose gel과 같은 역할 – 아크릴아마이드와 비스아크릴아마이드는 신경독이므로 주의 4-1) 필요한 재료 및 시약
• 아크릴아마이드와 비스아크릴아마이드는 신경독입니다. 모든 단계는 무분말 장갑을 착용하고 실시하여 주십시오. 4-2)시료 제조/단백질 시료(세포 또는 조직 용해물)의 용량까지 동일한 용량의 로딩 버퍼를 첨가합니다. • 위의 혼합물을 95℃에서 5분간 끓입니다. 16000xg로 5분간 원심 분리합니다. • 이 시료는 -20℃에 보관하거나 겔 전기영동 준비에 사용할 수 있습니다. Note) – 구조를 풀기 위해 가열한다. 4-3) Resolving gel(Separating gel) 준비 및 겔 캐스팅 장치의 유리판과 스페이서를 탈염수와 에탄올로 세척합니다. • 안정적이고 균일한 표면에서 유리판과 스페이서를 조립합니다. • 필요한 겔의 비율에 따라 다음 용량(10mL용)을 사용하여 ‘Resolving gel 용액’을 준비합니다. • 아크릴아마이드와 비스아크릴아마이드는 신경독입니다. 모든 단계는 무분말 장갑을 착용하고 실시하여 주십시오. 4-2)시료 제조/단백질 시료(세포 또는 조직 용해물)의 용량까지 동일한 용량의 로딩 버퍼를 첨가합니다. • 위의 혼합물을 95℃에서 5분간 끓입니다. 16000xg로 5분간 원심 분리합니다. • 이 시료는 -20℃에 보관하거나 겔 전기영동 준비에 사용할 수 있습니다. Note) – 구조를 풀기 위해 가열한다. 4-3) Resolving gel(Separating gel) 준비 및 겔 캐스팅 장치의 유리판과 스페이서를 탈염수와 에탄올로 세척합니다. • 안정적이고 균일한 표면에서 유리판과 스페이서를 조립합니다. • 필요한 겔의 비율에 따라 다음 용량(10mL용)을 사용하여 ‘Resolving gel 용액’을 준비합니다.
• 스페이서와 함께 조립된 판에 겔 용액을 붓습니다. • 균일하고 수평한 Resolvinggel 표면을 유지하려면 물 또는 이소프로판올로 표면을 덮습니다. • 상온에서 약 20~30분간 겔을 굳힙니다. 4-4) Stacking gel 겔 준비• 다음 용량(10ml용)을 사용하여 Stacking gel 용액을 준비합니다. • 스페이서와 함께 조립된 판에 겔 용액을 붓습니다. • 균일하고 수평한 Resolvinggel 표면을 유지하려면 물 또는 이소프로판올로 표면을 덮습니다. • 상온에서 약 20~30분간 겔을 굳힙니다. 4-4) Stacking gel 겔 준비• 다음 용량(10ml용)을 사용하여 Stacking gel 용액을 준비합니다.
• Resolving gel 위에 덮인 물 또는 이소프로판올을 버립니다. • 5%의 축적 겔 용액을 넘칠 때까지 첨가합니다. • 겔 또는 웰 근처에 기포가 갇히지 않도록 즉시 콘을 삽입합니다. • 상온에서 약 20~30분간 겔을 굳힙니다. 4-5) Running Buffer 준비 · 300ml: Tris 3g + Glycine 14.4g + 10% SDS 10ml Note)-APS:Ammonium persulfate-Q)겔의 농도가 높으면 어떤 변화가 생길까? (다음시간) [수업복습용] 빈칸에 맞는 단어를 쓰거나 괄호 안에서 문맥상 맞는 단어를 고르시오. 1. single cell RNA sequencing은 있지만, single cell protein analysis는 없다. 단백질은 증폭되지 않기 때문이다. 따라서 단백질은 다른 방법으로 분석해야 한다. 단백질이 있는지 없는지, 있다면 단백질의 양은 상대적으로 어떤 것인지를 측정하는 단백질 분석법의 골드 스탕달은( )이다. 이 경우 DNA 전기영동과 마찬가지로 단백질을 크기별로 분리하기 위해 (-)법이 중간에 사용된다. 2. 단백질 분석법의 gold standard는 ( )라고 할 수 있다. 이 실험법에서는 우선 단백질을 모은 뒤 RIPA buffer 등을 이용해 세포를 분해하고 단백질을 뽑아내는 과정이 필요하다. 이것을 cell()이라고 한다. 이후 단백질을 크기별로 분리하기 위해 (-)를 실시한다. 이후 전기를 이용해 단백질을 gel에서 PVDF 또는 nitrocellulose막으로 옮겨야 하는데 이를 (-)라고 한다. 이후 형광염료 등이 부착된 1차, 2차 항체를 부착하는데 이를 antibody()라고 한다. 3. 단백질을 크기별로 분리할 때 가장 많이 사용하는 전기영동법은 (-)이다. ()는 detergent로 단백질은 모두 전하량이 제각각인데 이를 이용하면 아미노산에 일률적으로 ()전하를 부여할 수 있다. 이렇게 아미노산 전하가 통일되고 나서 단백질을 분자량에 따라 분리할 수 있다. ()gel은 단백질이 전기장에 반응해 통과하도록 하는 몸 역할을 한다. 다만 이 겔은 신경독으로 작용하기 때문에 무분말 장갑을 착용한 뒤 만들어야 한다. 4. 단백질 전기영동을 실시한 후 단백질을 gel에서 PVDF 또는 nictrocellulose막으로 옮기는데, 이후 막을 BSA 또는 우유와 같은 [산성/중성/염기성] 단백질을 이용해 차단하는 과정이 필요하다. 항체의 FCregion은 면역세포 등 다수의 세포와 binding할 수 있는데, 이 때문에 FCregion이 원하는 단백질이 아닌 다른 단백질과 불특정하게 결합하는 경우가 많다. 따라서 ()를 하지 않으면 원하지 않는 사인이 많이 생길 수 있다. Answers(9주차)1. western blot / SDS-PAGE2 western blot / lysis / SDS-PAGE / electro-transfer / probing3. SDS-PAGE / SDS / 음(-) / polyacrylamide4. 중성 / blocking • Resolving gel 위에 덮인 물 또는 이소프로판올을 버립니다. • 5%의 축적 겔 용액을 넘칠 때까지 첨가합니다. • 겔 또는 웰 근처에 기포가 갇히지 않도록 즉시 콘을 삽입합니다. • 상온에서 약 20~30분간 겔을 굳힙니다. 4-5) Running Buffer 준비 · 300ml: Tris 3g + Glycine 14.4g + 10% SDS 10ml Note)-APS:Ammonium persulfate-Q)겔의 농도가 높으면 어떤 변화가 생길까? (다음시간) [수업복습용] 빈칸에 맞는 단어를 쓰거나 괄호 안에서 문맥상 맞는 단어를 고르시오. 1. single cell RNA sequencing은 있지만, single cell protein analysis는 없다. 단백질은 증폭되지 않기 때문이다. 따라서 단백질은 다른 방법으로 분석해야 한다. 단백질이 있는지 없는지, 있다면 단백질의 양은 상대적으로 어떤 것인지를 측정하는 단백질 분석법의 골드 스탕달은( )이다. 이 경우 DNA 전기영동과 마찬가지로 단백질을 크기별로 분리하기 위해 (-)법이 중간에 사용된다. 2. 단백질 분석법의 gold standard는 ( )라고 할 수 있다. 이 실험법에서는 우선 단백질을 모은 뒤 RIPA buffer 등을 이용해 세포를 분해하고 단백질을 뽑아내는 과정이 필요하다. 이것을 cell()이라고 한다. 이후 단백질을 크기별로 분리하기 위해 (-)를 실시한다. 이후 전기를 이용해 단백질을 gel에서 PVDF 또는 nitrocellulose막으로 옮겨야 하는데 이를 (-)라고 한다. 이후 형광염료 등이 부착된 1차, 2차 항체를 부착하는데 이를 antibody()라고 한다. 3. 단백질을 크기별로 분리할 때 가장 많이 사용하는 전기영동법은 (-)이다. ()는 detergent로 단백질은 모두 전하량이 제각각인데 이를 이용하면 아미노산에 일률적으로 ()전하를 부여할 수 있다. 이렇게 아미노산 전하가 통일되고 나서 단백질을 분자량에 따라 분리할 수 있다. ()gel은 단백질이 전기장에 반응해 통과하도록 하는 몸 역할을 한다. 다만 이 겔은 신경독으로 작용하기 때문에 무분말 장갑을 착용한 뒤 만들어야 한다. 4. 단백질 전기영동을 실시한 후 단백질을 gel에서 PVDF 또는 nictrocellulose막으로 옮기는데, 이후 막을 BSA 또는 우유와 같은 [산성/중성/염기성] 단백질을 이용해 차단하는 과정이 필요하다. 항체의 FCregion은 면역세포 등 다수의 세포와 binding할 수 있는데, 이 때문에 FCregion이 원하는 단백질이 아닌 다른 단백질과 불특정하게 결합하는 경우가 많다. 따라서 ()를 하지 않으면 원하지 않는 사인이 많이 생길 수 있다. Answers(9주차)1. western blot / SDS-PAGE2 western blot / lysis / SDS-PAGE / electro-transfer / probing3. SDS-PAGE / SDS / 음(-) / polyacrylamide4. 중성 / blocking